Makalah Bio Molekuler │ PCR. subject: thalasemia

BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Dunia sekarang sedang mengalami perkembangan teknologi secara besar-besaran. Hal ini dapat kita rasakan dalam berbagai bidang, salah satunya adalah bidang kedokteran. Sebagai contoh dari perkembangan teknologi kedokteran adalah ditemukannya ilmu biologi molekuler. Biologi molekuler merupakan salah satu cabang biologi yang merujuk kepada pengkajian mengenai kehidupan pada skala molekul. Ini termasuk penyelidikan tentang interaksi molekul dalam benda hidup dan kesannya, terutama tentang interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan sintesis protein, dan bagaimana interaksi tersebut diatur. Biologi molekuler memberikan kontribusi yang amat sangat nyata dalam bidang kedokteran. Dahulu, untuk mengetahui penyakit yang diderita harus dengan menemukan organisme penyebab penyakit tersebut didalam tubuh. Dan jika tidak ditemukan pasien dinyatakan negatif dan tidak diberikan tindakan apapun. Padahal kenyataanya tidak semua penyakit organisme penyebabnya dapat ditemukan dengan mudah. Namun dengan adanya biologi molekuler dokter dapat memeriksa penyebab sampai dengan pada DNA pasien.

Sehingga nyata benar ilmu tersebut sangat bermanfaat. Biologi molekuler juga dapat mendeteksi penyakit-penyakit yang bersifat genetis. Dalam skenario kali ini membahas tentang penyakit thalassemia. Thalassemia adalah penyakit herediter yang disebabkan oleh adanya kekurangan rantai globin pembentuk hemoglobin (Hb), baik rantai globin α (Thalassemia α) maupun rantai globin β (Thalasemia β). Thalassemia termasuk penyakit akibat gangguan gen tunggal (single gene disorders) dengan pola pewarisan yang menuruti hukum-hukum Mendel. Gangguan yang berupa kekurangan rantai globin tersebut menimbulkan serangkaian gejala klinis dan laboratorik, yang dapat ditemukan melalui pemeriksaan fisik dan laboratorik. Namun pada penderita-penderita tertentu gejala klinis maupun fisik sangat minim atau bahkan tidak ada. Keadaan seperti ini umumnya didapat pada penderita heterozygot atau yang bersifat minor. Dalam keadaan ini diagnosa hanya dapat ditegakkan melalui analisis DNA. Inilah yang dimaksud dengan diagnosis molekuler. Dahulu bayi yang lahir dengan kelainan darah, meninggal pada usia kurang dari setahun. Namun sekarang ini sebagian bisa besar selamat dengan diagnosis dan penatalaksanaan lebih lanjut.

B. TUJUAN

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut :

·      Untuk melaksanakan tugas Biologi Molekuler

·      Menjadi Pegangan bagi Mahasiswa yang ingin memahami konsep Manfaat PCR dalam bidang kesehatan “Diagnosa Penyakit Thalasemia”.

·      Menjadi referensi tambahan yang menunjang keberhasilan pembelajaran matakuliah Biologi Molekuler.

·      Mengetahui peran PCR dapam mendiagnosa penyakit Thalasemia

C. MANFAAT

1.      Selain untuk memenuhi tugas yang diberikan, makalah ini juga menjadi sumber referensi bagi penulis serta pembaca.

2.      mengetahui peran PCR dalam mendiagnosa penyakit khususnya mendiagnosa penyakti Thalasemia

3.      Memahami dan mengerti penyakit thalassemia lebih lanjut.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. HEMOGLOBIN MANUSIA

Hemoglobin adalah metaloprotein pengangkut oksigen yang mengandung besi dalam sel merah dalam darah mamalia dan hewan lainnya. Molekul hemoglobin terdiri dari globin, apoprotein, dan empat gugus heme, suatu molekul organik dengan satu atom besi. (www.wikipedia.com)

Hemoglobin dapat dikelompokkan sebagai berikut:
o Pada manusia dewasa
- Hb Mayor : Hb A (2 rantai α dan 2 rantai β)
- Hb Minor : Hb A2(2 rantai α dan 2 rantai δ)
o Pada bayi dan janin
- Hb F (2 rantai α dan 2 rantai γ)
Ada 2 macam rantai γ yang berbeda pada asam amino no.136 yaitu:
a. Glisin ( G γ )
b. Alanin ( A γ )
- Hb Embrional : 1. Hb Gowers 1 (2 rantai ζdan 2 rantai ε)
2. Hb Gowers 2 (2 rantai α dan 2 rantai ε)
3. Hb Portland (2 rantai ζ dan 2 rantai γ)

Kadar Hb normal pada dalam tubuh manusia
a. Laki-laki : 13,6-17 g/dl
b. Perempuan : 12-15 g/dl
c. Anak-anak : 11-16 g/dl
d. Wanita hamil : 11-12 g/dl

Skema pembentukan Hb
Suksinil Co-A + glisin → molekul pirol → 4 molekul pirol → protoporfirin IX+Fe → Heme → Heme + rantai polipeptida (globin) → hemeglobin

B. GEN-GEN PENENTU RANTAI GLOBIN
1. kelompok α (Alpha Like)
             terdiri dari rantai alfa dan rantai zetaü
            berada di kromosom 16ü
            1-3’a2-a1-a susunan urutan gen : 5’-ζ-ψζ-ψü

2. kelompok β (Beta Like)
            terdiri dari rantai beta, gamma, delta dan epsilon.ü
            Berada di kromosom 11ü
             Susunan urutan gen : 5’-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3’ü

C. THALASSEMIA

Thalassemia termasuk penyakit akibat gen tunggal ( single gene disorders ) dengan pola pewarisan yang mengikuti hukum Mendel. Walaupun kelainan genetik penyebab thalassemia sangat beragam, namun hanya ada dua mekanisme saja yang dapat menimbulkannya :

1. Mutasi
2. Persilangan yang tidak berimbang ( unequal crossover )

Penyakit thalassemia disebabkan oleh adanya kelainan/perubahan/mutasi pada gen globin alpha atau gen globin beta sehingga produksi rantai globin tersebut berkurang atau tidak ada. Akibatnya produksi Hb berkurang dan sel darah merah mudah sekali rusak atau umurnya lebih pendek dari sel darah normal (120 hari). Bila kelainan pada gen globin alpha maka penyakitnya disebut thalassemia alpha, sedangkan kelainan pada gen globin beta akan menyebabkan penyakit thalassemia beta.

C. DIAGNOSIS MOLEKULER THALASSEMIA
a. PCR (Poilymerase Chaain Reaction )
b. DNA Sequencing
c. Southern Blotting
d. Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
e. Dot blotting

PCR ( Polimerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik untk mensintesis asam nukleat atau gen tertentu in vitro secara enzimatis. PCR merupakan teknik yang sensitive, spesifik dan singkat. Penggunaan PCR untuk membandingkan gen klon abnormal dengan gen klon serta analisis forensic evolusi untuk jaringan.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 108 – 109 kali (Retnoningrum, 1997).
PCR dibedakan menjadi 2 ; PCR konvensional, dan Real Time PCR
PCR konvensional.

PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA dapat langsung diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik. Dalam hal ini, metode yang digunakan disebut RT-PCR (reverse-transcription PCR). Tahapan dalam PCR dan RT-PCR konvensional dengan format deteksinya dapat dilihat pada gambar di atas.

Berbeda dengan PCR konvensioal, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini menawarkan beberapa keunggulan yaitu: deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman.

Kegunaan PCR:

PCR banyak digunakan untuk berbagai tujuan, misalnya mendiagnosis penyakit keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi seperti bakteri dan virus, mempelajari evolusi manusia, forensik dan lain sebagainya. Polymerase Chain Reaction atau sering disingkat sebagai PCR adalah suatu teknik perbanyakan materi genetik baik DNA yang terdapat pada kebanyakan mikroorganisme penyebab penyakit maupun RNA yang terdapat pada virus tertentu seperti virus imunodefisiensi manusia (HIV, penyebab AIDS) dan virus hepatitis C (HCV, penyebab hepatitis C). Karena kemampuan PCR untuk memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam suatu spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya. Secara umum, PCR dilakukan sebanyak 25 – 35 siklus

D. PENCEGAHAN

1.      melakukan coseling-family sebelum menikah

2.      Melakukan prenatal-screening.

BAB III
PEMBAHASAN

Pada awal pengembangannya PCR sebenarnya merupakan cara penggandaan DNA secara invitrp. Cara ini amat praktis, karena kecuali pelaksanaannya invitro juga cepar, sensitif, relatif murah dan automatisasi dapat diterapkan. Sebelum teksinik PCR ditemukan, penggandaan DNA dilakukan dengan kloning gen yang memerlukan waktu sampai10 hari.

Prinsip PCR adalah bila DNA dicampur dengan oligonukleotid yang komplementer dan diberi kondisi yang sesuai, maka oligonukleotid tadi akan berperan sebagai titik awal (primer) sintesis copy dari DNA target. Dengan menggunakan dua primer, satu disebelah hulu (5’) dan satu disebelah hiir (3’) (reverse primer, segmen DNA yang terletak di antara kedua primer tadi akan digandakan. Dalam sati siklus reaksi, satu untai DNA tunggal akan tergandakan menjadi 2 untai dengan n siklus, dari satu DNA untai tunggal teoritis akan dihasilkan 2ⁿ copy dengan 25 siklus dari satu DNA untai tunggal teoritis akan dihasilkan lebih dari 30 juta copy.

Dengan enzim Taq yang tahan panas sampai 100⁰C, dapat dicapai otomatisasi pengerjaan dan segmen DNA berukuran sampai beberapa kilo base pair (kb) dapat digandakan dalam waktu kurang dari3 jam. Metode ini sangat sensitif, DNA sejumlah 1 µg telah cukup untuk sampel. Dari single copy genes dapat diperoleh sejumlah copy  DNA cukup untuk dianalisis. Setetes darah kering pada kertas saringcukup untuk mendeteksi mutasi gen globin.

Sensitifitas yang amat tinggi dari PCR justru menyebabkan berbagai masalah: DNA kontaminan yang amat sedikitpun (misalnya dari sel dalam ludah, serpih kulit dari pemeriksa) akan ikut tergandakan sehingga terbentuk sejumlah copy DNA kontaminan. Penempelan primer secara non spesifik pada segmen DNA non target akan menghasilkan sejumlah copy  DNA non target. Hal ini dapat dihindari dengan membuat primer sespesifik mungkin, mislanya dengan menggunakan primer sespesifik mungkin, misalnya dengan menggunakan primer oligonukleotid yang tak terlalu panjang meupun terlalu pendek, memasukkan mismatched nucleotide yaitu pada -4 dari ujung 3’ untuk mempertinggi spesifisitas primer. Pada PCR dengan jumlah siklus yang amat banyak, misalnya kalau sampel DNA terlalu sedikit, dapat terbentuk dimer dari primer; dimer akan terlihat sebagai DNA dengan ukuran kira-kira 40 bp (base pair), biasanya mudah dikenalai sehingga tidak terlalu mwngganggu. Kekurangan aktivitas polimerase dari taq akan menyebabkan terjadinya salanh baca dan salah penggabungan basa (misincorporation); penanganan cermat sangat diperlukan.

Dengan PCR, delesi gen atau sejumlah nukleotid dapat terdeteksi sacar langsung dari gambaran elektroforesis secara langsnung dari gambaran elektroforesis DNA produk PCR berupa pita segmen DNA yang sekian bp lebih pendek daripada normal. Pada hidrop fetalis Hb Bart tidak terbentuk copy dari gen-α sebagai produk PCR karena penderita sama sekali tidak mempunyai gen-α yang bertindak sebagai cetakan (template). Winichagoon (1989) melaporkan bahwa dengan PCR mampu dideteksi delesi sepanjang hanya 4 bp pada kodon 41/42 (CTTT) dari gen-β.

BAB IV
PENUTUP

KESIMPULAN

Thalassemia adalah penyakit keturunan dengan gejala utama pucat, perut tampak membesar karena pembengkakan limpa dan hati.Thalassemia ditandai oleh penurunan produksi satu atau lebih rantai globin. Namun semua rantai menunjukkan rantai yang normal. Hal inilah yang membedakan thalassemia dengan hemoglobinopati.

PCR ( Polimerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik untk mensintesis asam nukleat atau gen tertentu in vitro secara enzimatis. PCR merupakan teknik yang sensitive, spesifik dan singkat. Penggunaan PCR untuk membandingkan gen klon abnormal dengan gen klon serta analisis forensic evolusi untuk jaringan. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi.

Dengan adanya PCR, kita dapat mengidentifikasi penyakit Thalasemia melalui pembacaan gen yang membantu dalam pemberian informasi.

DAFTAR PUSTAKA

Permono, Bambang,dkk.2005.Buku Ajar Hematologi-Onkologi Anak.Jakarta: Badan        Penerbit IDAI

Biologi molekuler. www.wikipedia.com
Hemoglobin. www.wikipedia.com

PCR. www.ariputuamijaya.wordpress.com/2011/12/10/pcr-polymerase-chain-        reaction/

PCR. rio-vet.blogspot.com/search/label/PCR

Penyakit genetik. www.mayoclinic.com

Thalasemia. www.putrisatriany.blogspot.com/2010/03/thalasemia.html

Thalasemia. www.scribd.com/doc/52830893/Thalassemia

Thalassemia. http://www.geocities.com/hamba66/HPA/talasemia/
Thalassemia. www.wikipedia.com
Thalassemia. www.bmj.com
Thalassemia. www.emidicine.com
Thalassemia. www.talasemia.com